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来自于乳酸菌发酵的食品防腐剂乳酸链球菌素

CHIHONBIO

乳酸链球菌素的特性及应用

一、简介

乳酸链球菌素(Nisin)是从乳酸链球菌发酵产物中提制的一种多肽抗菌素类物质,是一种世界公认的安全的生物性食品防腐剂和抗菌剂。早在1928年,Rogers和Whittier就发现乳酸链球菌的代谢产物能够抑制部分革兰氏阳性菌的生长。1944年Mattic和Hirsch发现血清学N群中的一些乳酸链球菌能产生蛋白类抑菌物质,命名为N_inhibitory Substance即N群抑菌物质,简称为Nisin。1951年,Hirsch等人应用Nisin到食品保藏中,成功的抑制了由产气梭状芽孢杆菌引起的奶酪腐败,极大改善了奶酪的品质。1953年由英国的阿普林和巴雷特公司首次以商品的形式出售了这种新的防腐剂———乳酸链球菌素。1969年,FAO/WHO食品添加剂联合专家委员会批准Nisin作为一种生物型防腐剂应用于食品工业。1988年美国食品和药物管理局(FDA)也正式批准将Nisin应用于食品中。我国在GB2760—2017中批准Nisin可用于乳及乳制品、食用菌和藻类罐头、八宝粥罐头、其他杂粮食品、方便米制品、方便面制品、预制肉制品、熟肉制品、熟制水产品、蛋制品、醋、酱油、酱及酱制品、复合调味料、除水之外的所有饮料。迄今为止,Nisin已在全世界约60多个国家和地区被用作防腐剂。Nisin分子由34个氨基酸残基组成,分子式为C30%H228N42O37S7,分子量为3330.31。Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA,它们通过硫醚键形成五个内环,其活性分子常为二聚体或四聚体。二聚体分子量为7000,四聚体分子量为14000。经过几十年的研究,人们已发现Nisin分子有6种类型,它们分别是A、B、C、E、Z中以Nisin A、Z类型的研究最为活跃。Nisin A,Nisin Z的差异仅在于氨基酸顺序上第27位氨基酸的种类不同。Nisin A是组氨酸(His),而Nisin Z是天门冬酰胺(Asn)。资料表明,同样浓度下Nisin Z的溶解度和抗菌能力都比Nisin A强。

二、抑菌机理及使用

Nisin的抗菌作用呈浓度依赖型,即和Nisin自身浓度、敏感菌细胞或芽孢浓度相关。Nisin具有抑菌(bacteriostatic)或杀菌(bacterdal)作用,这要依赖于目标微生物的生理状态和情况。处于能量状态的营养繁殖细胞较处于静止状态的营养繁殖细胞更易被杀死,研究证明处于发芽时期的孢子更容易被NISIN杀死,杀菌作用最常发生在目标微生物的最适pH、温度和水活度(aw)的情况下,相反食品中菌的抑制是在多重保护系统中获得最好的效果,这种多层保护系统称之为障碍技术(hurdle technololgy),它发生在菌的非最适pH, 温度和水活度(aw)的情况下。

Nisin对敏感Gram阳性营养繁殖细胞的作用缘于破坏细胞质膜。早期研究表明Nisin的作用于营养繁殖细胞后,细胞内物质迅速漏出,包括ATP和其它离子,伴随着膜电势的完全丧失。如果细胞质膜受到的作用较严重,可能发生细胞的完全溶解,主要的Gram阴性菌对Nisin呈耐受性,但能增加细胞壁穿透性的任何处理或试剂应用均会大大改善它们对Nisin的敏感性,实验表明当采用EDTA与NISIN联合使用时G-细菌表现得极度敏感。

Nisin对芽孢菌的作用模式是不同的,研究表明芽孢对Nisin远较产生芽孢的营养繁殖细胞敏感,虽然对有限数量的菌芽孢子作用已被证实,但对大多数菌是抑制芽孢作用,这种抑制芽孢作用是在芽孢上进行的,此作用在芽孢变模糊后,膨胀和生长前开始,这种作用在热加工食品如加工干酪的保藏中是重要的,这是因为有效量的Nisin可在整个食品贮存期内保存,另外芽孢的进一步热处理导致其对Nisin敏感性的增加。

Nisin能有效地抑杀许多G+菌,如乳杆菌(Lactobacillus)、分支杆菌(Mycobacterium)、微球菌(Micrococcus)、葡葡球商(Staphylococcus) 、肠球商(Enterococcus)、片球菌(Pediococcus)、明串珠菌(Leuconostoc) 、李斯特氏菌(Listeria) 和链球菌属(Streptococcus)等;对芽孢杆菌(Bacillus)和梭状芽孢杆商(Clostridium)细胞及其芽孢的萌发也有抑制作用。通常情况下. Nisin对G-没有作用,然而,在某些情形下能对外膜破裂的G-菌起作用, Nisin对一般G-菌、霉菌和酵母性没有作用,许多因素影响Nisin抑菌洁性与效力。

Nisin对敏感营养繁殖细胞和G+性菌芽孢的最小抑制浓度明显不同,既使在相同菌的不同品系亦有不同,G+性敏感菌包括下列菌:Pediocooccus、Lactobacillus、Lactoccus、leuconostocMicroccus,产芽孢菌cocstridium, DesulfotolmaculumBacillus。能被Nisin有效抑制的Clostridium包括C.Sporogenes、C.lentoputrescens, C.tyrobutyricum C.butyricum,它们和加工干酪的腐败密切相关。由于Nisin主要用于营养繁殖细胞已被热处理杀死的食品,耐热菌B.Stearothermophilus C.thermosaccharolyticum的芽孢对Nisin呈高敏感性,25mg/kg的Nisin对它们表现出有效性。其它Bacillus芽孢在>2500mg/kg, 情况下被抑制,而B.cereusIB,megateriumB.polymyxa Nisin抑制的有效范围分别为1870~2500、650~2500、650~1250mg /kg。

表一 典型的乳链菌素添加浓度和Nisinpro在食品中的应用情况

食品应用

典型微生物

NisinPro浓度(mg/L)

融化干酪

梭菌属、芽孢杆菌属

200-600

巴氏灭菌牛奶和奶制品

梭菌属、芽孢杆菌属

10-400

巴氏灭菌冷汤

蜡状芽孢杆菌、巴氏芽孢梭菌

100-200

烤饼

蜡状芽孢杆菌

150-250

罐装食品(高酸)

肉毒梭状芽孢杆菌、热解糖梭菌

100-200

意大利乳清干酪

单核细胞增生李斯特氏菌

100-200

早餐型烹调香肠

乳酸菌、单核细胞增生李斯特氏菌

200-1000

浸蘸酱油

乳酸菌

50-250

沙拉调味品

乳酸菌

50-200

啤酒

乳酸菌

1000-1500

酒花酵母

啤酒(威尔士)

 

 

快速发酵

 

10-50

表二、乳酸链球菌素的抗菌谱

Organism (no. of strains)

MIC. (ppm)(1000IU/mg)

Micrococcus spp. (4) 微球菌属

44

Enterococcus spp. (12) 肠球菌属

668

Listeria spp. (23) 李斯特菌属

168

Staphylococcus spp. (19) 葡萄球菌属

168

Streptococcus spp. (17) 链球菌属

336

Bacillus spp. (5) 杆菌属

168

Clostridium spp. (4) 梭状芽孢杆菌属

44

Actinomyces viscosus (2) 粘质放线菌属

3344

Peptostreptococcus spp. (2) 消化链球菌属

84

Corynebacterium diphtheriae (1) 白喉杆菌

168

Gardnerella vaginalis (1) 加德纳菌属

44

Mycobacterium smegmatis (2)

336

Propionibacterium acnes (2) 疮胞丙酸杆菌

84

Campylobacter jejuni (1)

44

Haemophilus influenzae (1) 流感嗜血杆菌

2676

Helicobacter pylori (2) 幽门螺杆菌

12

Neisseria spp. (13) 奈瑟菌属

336

Nisin对C.botulinum芽孢的敏感性应给予特别注意,美国的研究表明在培养基中Nisin能有效防止C.botulinum的A,B,C型芽孢生长,Nisin对C.botulinum芽孢防止的有效性随下列因素的变化而增加:降低pH、增加热击昏的时间和温度、减少芽孢负载。

Nisin是由原料乳中天然存在的Lactococcus菌产生的,故认为它是无害的,因为人和动物摄人数个世纪也没有引起任何副作用。产Nisin的L.lactis在天然大量存在,科学工作者进行的251个原料乳样品的检测中发现,109个样品中含有产Nisin的L.lactiso。对远超过食品应用量的Nisin的毒性研究表明,Nisin是无毒的,Nisin在肠道可被消化酶迅速失活,在食用含Nisin的液体10min后就无法在人的唾液中测定到Nisin的存在,现也没有发现对Nisin过敏的情况,大量的微生物学研究表明:Nisin和治疗的抗生素间无任何交叉性的互相抵消作用。1963年 FAO/WHO专家委员会确认了Nisin的毒性数据,推荐了它在食品中的应用量,现在Nisin已在约60个国家得到应用,包括欧共体、美国和中国。它在食品中的用量在各不同国家间有所不同,以加工干酪产品和罐头食品应用最为广泛。

Nisin在酸性底物中较易溶解,pH上升溶解性下降,当pH为2时溶解约为5.6%,pH5时为3%, pH7仅为1%,因为在食品保藏中Nisin的应用水平很少大于250PPM(0.025%),故溶解性不是其食品中应用的问题,商业制备物含有来自发酵的蛋白质,溶解时会产生絮状沉淀,它们对Nisin的效率没有不良影响。随着提取技术的不断进步这种问题正在逐步得到解决。

三、稳定性研究:

(一)、pH=2条件下,在不同温度下加热20分钟,乳酸链球菌素失活数据对照表。

对照

100%

45℃

98.50%

65℃

97.70%

80℃

96.20%

100℃

94.80%

115℃

92.50%

121℃

85.10%

配制100ppmNisin溶液,滤膜过滤消毒于灭菌试管中,分别放置于4、20、30度环境下6周,每周分别测其抑菌活性,结果见图。各组随时间的延长,Nisin活性均逐渐下降。

放置温度

4℃

20℃

30℃

对照

100%

100%

100%

7天

98.50%

93.30%

91.80%

14天

94.00%

91.80%

85.50%

21天

92.50%

85.50%

81.90%

28天

83.70%

85.90%

75.70%

35天

85.90%

75.70%

69.30%

42天

83.70%

69.30%

65.80%

(二)、pH对NISIN抑菌活性的影响

Nisin溶液,用1mol/L氢氧化钠溶液和1mol/L盐酸溶液分别调pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0),进行抑菌实验,结果表明在酸性条件下抑菌活性最高,随pH的上升抑菌活性逐渐下降。

pH

 相对抑菌活性

2.0

99.2%

3.0

100.0%

4.0

96.2%

5.0

88.8%

6.0

72.9%

7.0

55.0%

(三)、不同温度及不同pH条件下处理20分钟后抑菌活性

数据表明在酸性条加下nisin在高温条件下仍具有较高的活性。对照组pH=3.3,不进行热处理为100%。

pH

80度

100度

115度

121度

2.0

97.70%

97.70%

91.00%

83.70%

3.0

98.50%

91.80%

84.40%

75.00%

4.0

90.30%

83.70%

75.00%

68.60%

5.0

77.10%

75.00%

65.20%

51.80%

6.0

67.20%

58.40%

43.00%

10.00%

7.0

53.70%

45.50%

38.30%

10.00%

四、质量指标

乳酸链球菌素(Nisin)是从乳酸链球菌发酵产物中提取的一种多肽抗菌素,由于乳酸链球菌素为非结晶性物质,因此制备高纯度产品是困难的。根据GB 1886.231-2016质量标准之规定共有以下检测项目:

项目

标准

检测方法

产品外观

乳白色至浅棕色粉末

将适量试样均匀置于白瓷盘内,在自然光线下观察其色泽 和状态

含量

≥900 IU/mg

生物效价法

干燥失重

≤3.0%

GB/T5009. 3

氯化钠

≥50%

GB/T5009. 42

pH(1%溶液)

3.2-3.8

GB/T5009.237

铅(Pb)

≤1mg/Kg  

GB/T5009. 75

菌落总数

≤10cfu/g

GB/T4789.2

大肠埃希菌

<3.0MPN/g

GB/T4789.3

大肠菌群

<3.0MPN/g

GB/T4789.38

沙门氏菌

不得检出

GB/T4789.4

根据以上项目分析,如果产品质量指标达到最低要求,产品中将可能会有44.75%的未知物质,这些物质为发酵液中不能分离的蛋白质或者干燥中加入的辅料。未知物质的存在将会对产品的外观、气味产生不良的影响,甚至会影响产品的溶解特性及在食品中的分散。因此,我们认为衡量产品是否有优质的重要指标是不仅满足法定指标,更重要的是使氯化钠的含量达到最大化,这样可保证未知杂质的最小化。奇泓生物产品氯化钠一般在90-93%之间,乳酸链球菌素含量控制在2.5-2.75%,这样未知杂质含量在1.25-4.5%之间。独特的生产工艺确保了产品质量。


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